Contact Us
TEL: +86-571-86217390
E-mail: sales@gihichemicals.com
Address: No.7, Huacai International Building, Dengcai Road, Sandun, Westlake District, Hangzhou, Zhejiang
Factory links: www.gihichem.com
Home > Knowledge > Content
Adelmidrol, A Palmitoylethanolamide Analogue, Reduces Chronic Inflammation(Newest Scientific Research)
Aug 03, 2018

J. Cell. Mol. Med. Vol 13, No 6, 2009 pp. 1086-1095(If you are interested in this scientific article on Adelmidrol,please check this original article via this reference informaiton of Journal)

 

 

 

Adelmidrol, a palmitoylethanolamide analogue, reduces chronic inflammation in a carrageenin-granuloma model in rats

 

Daniele De Filippis a, b, Alessandra D’Amico a, b, Maria Pia Cinelli c, Giuseppe Esposito d, Vincenzo Di Marzo a, e, Teresa Iuvone a, b, *

 

a Endocannabinoid Research Group

b Department of Experimental Pharmacology, Università of Naples “Federico II”, Naples, Italy

c Dipartimento di Scienze Biomorfologiche,  Via Pansini University of Naples “Federico II”, Naples, Italy

d Department of Human Physiology and Pharmacology V. Erspamer” University of Rome “La Sapienza”, Rome, Italy

e Institute  of Biomolecular Chemistry, Consiglio Nazionale delle Ricerche, Pozzuoli, Naples, Italy

 

Received: December 14, 2007; Accepted: April 14, 2008

 

 

Abstract

 

Palmitoylethanolamide (PEA) and some of its analogues have shown great efficacy in the treatment of pain and inflammation. Adelmidrol

 the International Nonproprietary Name (INN) of the di-amide derivative of azelaic acid  is one of these analogues. The anti-inflamma- tory and analgesic effects of PEA and adelmidrol  are hypothesized to be mediated, at least in part, by mast cell down-modulation. Mast cell mediators  released at early stage of the inflammatory  process drive the inflammatory  reaction to chronicity as it happens in λ-carrageenin-induced granulomatous tissue formation. In the present study, the choice of testing adelmidrol depends upon the physic- ochemical properties of the compound, i.e. the amphipatic feature, that make it more easily soluble than PEA. In this study, we investi- gated the effect of adelmidrol on granuloma formation induced by λ-carrageenin-soaked sponge implant in rats. Our results show that the local administration of the compound under study significantly  decreases weight and neo-angiogenesis in granulomatous tissue. The anti-inflammatory  effect was due to the modulation of mast cells degranulation, as shown by histological analysis and by the inhibition of the release of several pro-inflammatory  and pro-angiogenic  enzymes (e.g. iNOS, chymase and metalloproteinase MMP-9), and mediators (e.g. nitric oxide and TNF-α). The results indicate that adelmidrol, given locally, may represent a potential therapeutic tool in controlling chronic inflammation.

 

Keywords: inflammation  mast cells  palmitoylethanolamide  adelmidrol

 

Introduction


 

Adelmidrol is the International Nonproprietary Name (INN) of a synthetic derivate of azelaic acid, a naturally occurring  saturat- ed dicarboxylic acid, that is found in some whole grains and in trace amounts in the human body [1], its plasma levels normal- ly ranging from 20 to 80 ng/ml. Chemically, ademidrol is the N,N -bis  (2-hydroxyethyl) non  anediamide and  it  is  an amphiphilic or amphipathic compound, possessing both hydro- philic and hydrophobic properties, that favour its solubility both in aqueous and organic media. The physicochemical properties of the compound make it particularly suitable for topical appli-

 

 

*Correspondence to: Prof. Teresa IUVONE, Dipartimento di Farmacologia Sperimentale, Università of Naples “Federico II”,

Via D. Montesano 49, Napoli 80131, Italy. Tel.: +39-081678429

Fax: +39-081678403

E-mail: iuvone@unina.it


cation and an adelmidrol (2%) emulsion has recently shown some benefit in a pilot study on mild atopic dermatitis [2]. The effect of adelmidrol has been shown to depend, at least in part, on the control of mast cell activation. Densitometric and mor- phometric analyses  of skin biopsies from experimental  skin wounds showed that treatment with  adelmidrol led to  an increase in the mast cell granular density, thereby suggesting a decrease in their degranulation [3, 4]. According to chemical structure and cellular mechanism of action, adelmidrol hence belongs to the family of ALIAmides  (Autacoid Local Injury Antagonist Amides), i.e. fatty acid amides, whose purported mechanism  of  action is the down-modulation  of  mast cell degranulation [5–7]. Palmitoylethanolamide  (PEA) is consid- ered to be the parent molecule of ALIAmides.  PEA is naturally present both in animal and vegetable tissues [8, 9] and is able to enhance both the cannabinoid and vanilloid signalling sys- tems [10], down-regulating the degradation pathways of endo- cannabinoid and endovanilloid compounds [11, 12]. The exact


 

 


mechanism of action of PEA is not yet well known although PEA may interact with peroxisome proliferator-activated receptor-α, which seems to be involved in some of its anti-inflammatory effects [13] and with the orphan G-protein-coupled  receptor, GPR55  [14]. The anti-inflammatory and analgesic  effects of PEA have been repeatedly reported  [15–19] and are thought to be due, at least in part, to its ability to down-modulate mast cell activation and mast cell mediator  release both in vitro [5, 20,

21] and in vivo [22, 23]. Mast cells are highly specialized

immune effector cells that, according with their granule con- tent, may be divided into two subpopulations: mucosal mast cells mainly present in the mucosa of respiratory and intestin- al tracts, and connective mast cells placed preferentially in skin [24]. Following either classical immunological  IgE-dependent activation or in response to a variety of stimuli [25], mast cells release their stored and newly synthesized mediators,  includ- ing cytokines  (TNF-α), histamine and pro-inflammatory  and pro-angiogenic mediators such as chymase, collagenase, nitric oxide, IL-1 and IL-6 (for a review see [26]). Mast cells are now considered  a master player in the promotion and perpetuation of  chronic skin inflammation [27]  and have recently been defined as a ‘central  cellular  switchboard  of pruritogenic skin inflammation [28]. We have shown that mast cell mediators, released at early stage of the inflammatory  process, play a piv- otal role in a classical model  of chronic inflammation,  i.e. the λ-carrageenin-induced granuloma formation [29]. In fact, dur- ing granuloma, mast cell-derived vasoactive mediators trigger the angiogenic process essential for the maintenance of tissue perfusion and for sustaining cellular traffic [30]. Both these events are strictly required for the development of the cuta- neous granulomatous tissue [31]. On all these assumptions, the aim of  the present study is  to  evaluate  the effect of adelmidrol, which for its chemical structure is prearranged to control dermatological pathologies, in a model of chronic cuta- neous inflammation  sustained by mast cells, i.e. granuloma induced by λ-carrageenin-soaked sponge implantats.

 

 

 

 

Materials and methods

 

Sponge implantation

 

Male Wistar rats (Harlan, Italy), weighing 200–220 g, were used in all experiments. Animals were provided with food and water ad libitum. The light cycle was automatically controlled (on 07 hrs 00 min.; off 19 hrs 00 min.) and the room temperature thermostatically  regulated to 22 ± 1°C with 60 ± 5% humidity. Prior to the experiments, animals were housed in these conditions for 3–4 days to become acclimatized. Sponges were implanted as previously described by De Filippis  et al. [31]. Briefly, two polyether sponges (0.5 x 1.5 x 2.0 cm) weighing 0.035 ± 0.002 g were implanted subcutaneously on the back of rats (n = 12–18 for each group) under general anaesthesia with pentobarbital (60 mg/kg). Sponges and surgery tools were sterilized by autoclaving for 20 min. at 120°C. λ-car-

rageenin (1% w/v) (Sigma) was dissolved in pyrogen-free saline and injected into each sponge in presence or absence of 100 μl of different adelmidrol solution (15, 30, 70 mg/ml) in final volume of 0.5 ml/sponge; saline (0.5 ml/sponge) was used as control. In some  experiments GW6471 (5 mg/ml), a well-known  antagonist  of PPAR-alpha receptor was added in the presence of the highest concentration of Adelmidrol. Ninety-six hours after sponge implant, rats were killed in atmosphere of CO2.  The granulomatous tissue around the sponge was dissected by using a surgical  blade, weighted, quickly  frozen in liquid nitrogen, and stored at -80°C. Animal care as well as all experiments were in accor- dance with European  Community Council Directive 86/609/EEC  and efforts were made to minimize animal suffering and to reduce the num- ber of animals used.

 

 

Evaluation of angiogenesis

 

Angiogenesis was evaluated by both haemoglobin content measurement and histological investigations.

 

 

Haemoglobin content measurement

The granulomatous tissue, i.e. the new formation tissue encapsulating the sponge, was collected and measured with a balance weighting  min 0.02 to max 300 g (KERN EG300-EM) always by the same person who was blind- ed for the treatments. In some experiments, the granulomatous tissue was homogenized  on ice with the Polytron PT300 tissue homogenizer  in

1 x PBS (4 ml each g of wet weight).  Briefly,  after  centrifugation  at

2500 x g for 20 min. at 4°C, the supernatants were further centrifuged at

5000 x g for 30 min. and haemoglobin concentration in the supernatant was determined spectrophotometrically  at 450 nm performed with the haemoglobin assay kit (Sigma Diagnostic). The haemoglobin content was expressed as mg haemoglobin/g of wet weight.

 

 

Histological investigation

After 96 hrs from sponge implants, the granulomatous tissue around the sponge was removed and fixed in 10% formalin. Paraffin-wax sections were cut at 4–6 μm and stained with haematoxylin and eosin for the eval- uation of blood vessels.

 

 

Mast cell counting

Thin (0.5 μm) paraffined section were prepared and stained with toluidine blue according to  Iuvone et  al.  [25]  and then processed for  light microscopy examination. MC counting was performed on five randomly selected sections using a x100 objective lens.

 

 

MPO activity

 

Myeloperoxidase (MPO) activity, an indicator of polymorphonuclear (PMN) accumulation, was determined. Granulomatous tissues were homogenized in a solution  containing  0.5% (w/v) hexadecyl-trimethyl-ammonium bro- mide dissolved in 10-mm potassium  phosphate buffer (pH 7) and cen- trifuged for 30 min. at 20,000 g at 4°C. An aliquot of the supernatant was then allowed to react with a solution  of tetra-methyl-benzidine (1.6 mm) and 0.1 mm H2O2.  The rate of change  in absorbance  was measured


 

 


spectrophotometrically at 650 nm. MPO activity was defined as the quan- tity of enzyme degrading 1 mmol of hydrogen peroxide/min at 37°C and was expressed in units per gram weight of wet tissue.

 

 

Nitrite assay

 

Nitrite production, as the stable metabolites of nitric oxide, was measured in  24-hrs-cultured granulomatous  tissues supernatants.  Briefly, the granulomatous tissues were weighted and plated in a 6 multi-wells plate according to Iuvone et al. [32]. After 24 hrs, the medium of cultured gran- ulomatous tissue (0.1 ml) was added to an equal amount of Griess reagent (1% sulphanilamide, 0.1% naphtylendiammine, 2.5% H3PO4) and allowed at room temperature for 10 min. The absorbance of constituted chro- mophore was determined using a UV/visible spectrophotometer at 550 nm. Nitrite levels were determined using a sodium  nitrite standard curve and expressed as μmol/l.

 

 

Nitrite and nitrate assay

 

Nitrite and nitrate production were evaluated  in granulomatous  tis- sues. Briefly, tissues were cooled in  ice-cold distilled saline and homogenized. The crude homogenate was centrifuged  at 21.000 g for

20 min. at 4°C, and aliquots of the supernatant were used to calculate NOx levels. Nitrite present in the samples was determined by reducing nitrate enzymatically  performed with the enzyme  nitrate reductase (Sigma-Aldrich, Dorset, UK) and Nicotinamide-Adenine  Dinucleotide Phosphate (NADPH) at room temperature (RT) for 3 hrs. The amount of NOx was measured following  the Griess reaction  Iuvone et al. [25].

 

 

Western blot analysis

 

Granulomatous tissues were weighted and rapidly homogenized in 60 μl of ice-cold hypotonic lysis buffer (10 mm HEPES, 1.5 mm MgCl2, 10 mm KCl, 0.5 mm phenylmethylsulfonyl fluoride, 1.5 μg/ml soybean trypsin inhibitor, pepstatin A 7 μg/ml, leupeptin 5 μg/ml, 0.1 mm benzamidine,

0.5 mm dithiothreitol [DTT]) and incubated in ice for 45 min. After this time, the cytoplasmic fractions were then obtained by centrifugation at

13,000 g for 1 min. and protein concentration in the samples was deter-

mined with Bio-Rad assay kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) according to the manufacturers instructions. Immunoblotting analysis of inducible nitric oxide synthase (iNOS), tumour necrosis factor-α (TNF-α) Chymase and MMP-9, CD-31, Tubulin were performed on a  cytosolic fraction of cultured specimens. Cytosolic fraction proteins were mixed with gel loading buffer (50 mm Tris, 10% SDS, 10% glycerol 2-mercap- toethanol, 2 mg bromophenol/ml) in a ratio of 1:1 v/v, boiled for 5 min. and centrifuged at 10,000 g for 10 min. Protein concentration was deter- mined and equivalent amounts (50 μg) of each sample were separated under reducing conditions in 12% SDS-polyacrylamide minigel. The pro- teins were transferred onto nitrocellulose  membrane according to the manufacturers instructions (Bio-Rad Laboratories). Depending upon the experiments,  the membranes were blocked by  incubation at  4°C overnight in high salt buffer (50 mm Trizma base, 500 mm NaCl, 0.05% Tween-20) containing 5% bovine serum albumin; they were then incubat- ed for 1 hr with anti-iNOS (1:2000 v/v) (BD Biosciences, Pharmingen, Italy), anti-TNF-α (1:250 v/v) (Sigma Aldrich), anti-Chymase (1:500 v/v)

(NeoMarkers, Fremont, CA, USA), anti-MMP-9  (1:100 v/v) (NeoMarkers), anti-CD-31 (1:1000v/v) (Diaclone, France) and anti-beta Tubulin (1:1000) (Sigma Aldrich) for 2 hrs at room temperature, followed by incubation with specific horseradish  peroxidase (HRP)-conjugate  secondary anti- body (Dako, Glostrup, Denmark). The immune complexes were devel- oped performed with enhanced chemiluminescence  detection reagents (Amersham,  Italy), according to the manufacturers  instructions and exposed to Kodak X-Omat film. The protein bands of proteins on X-ray film were scanned and densitometrically  analysed with a GS-700  imag- ing densitometer (Bio-Rad Laboratories).

 

 

Statistics

 

Results were expressed as the mean ± S.E.M. of n animals where each value is the average of responses in duplicate sites. Statistical comparisons were made by one-way ANOVA followed by Bonferronis test for multiple comparisons.  P < 0.05 was considered to be significant.

In all set of experiments, analysis of linear regression was performed to evaluate a concentration-dependent  relationship.

 

 

 

Results

 

Effect of adelmidrol on granuloma formation

 

The implant of λ-carrageenin-soaked sponges on the back of rats caused a significant  increase of granulomatous tissue formation around the sponge at 96 hrs, evaluated as the wet weight of tissue around the sponge (1.67 ± 0.079 g versus saline 0.61 ± 0.042 g; P < 0.001). Single administration, at time 0 (i.e. the implantation time), of adelmidrol (15, 30, 70 mg/ml) resulted in a significant and concentration-dependent  decrease in granuloma formation (by 15, 28, 44% respectively;  P < 0.001). The ademidrol effect, on granulomatous  tissue formation, was not reversed  by the usage of GW6471,  a potent and selective antagonist of PPAR- alpha receptor (Fig. 1A).

 

 

Effect of adelmidrol on leucocyte infiltration

 

Adelmidrol (15, 30, 70 mg/ml)  decreased in a significant and con- centration-dependent way the leucocyte infiltration in the granulo- matous tissue, at 96 hrs, evaluated as myeloperoxidase activity (21, 44, 72% inhibition,  respectively; P < 0.001) as compared to λ-carrageenin alone (1.8 ± 0.54 mU/100 mg wet tissue; P < 0.001 versus saline) (Fig. 1B).

 

 

Effect of adelmidrol on pro-inflammatory markers

 

The effect of adelmidrol on two of the most studied pro- inflammatory  markers was evaluated. Adelmidrol (15, 30, 70 mg/ml) showed a  significant and concentration-dependent  inhibition


Effect of adelmidrol on nitrite production

 

Adelmidrol strongly reduced nitrite and nitrate, stable metabolites of nitric oxide, evaluated both in homogenates from granulomatous tissue at the explant time (26, 40, 73% inhibition  versus carrageenin alone 37 ± 0.600 μmoli/tissue; P < 0.001) and released from tissue cultured in plates for further 24 hrs (23, 46, 69% inhibition versus carrageenin alone 33 ± 0.4 μmol/tissue; P < 0.001) (Fig. 3A and B).

 

 

Effect of adelmidrol on mast cells

 

Fig. 4A shows the toluidine blue stained granulomatous  tissue sections. Treatment with λ-carrageenin (b) induced  a significant mast cell degranulation (light blue stained cells, i.e. degranulated cells, in comparison  to the deep blue stained cells, i.e. non- degranulated mast cells); moreover, histological analyses showed that mast cells are predominantly located in close proximity to blood vessels. Adelmidrol (c) was able to reduce mast cell degran- ulation. Moreover, histological analysis of granulomatous tissue showed that adelmidrol (70 mg/ml), locally administered at time

0, reduced the number of mast cells by 52% (P < 0.001) in com-

parison to carrageenin alone (104.66 ± 1.67 number of mast cells

P < 0.001 versus saline) (Fig. 4B).

The results are paralleled to the Western blot analysis for both chymase (Fig. 4C) and MMP-9 (Fig. 4D) protein expression that were found to be significantly and concentration-dependently reduced by adelmidrol (15, 30, 70 mg/ml), respectively by 24, 39,

57% (P < 0.001 in comparison to carrageenin alone 9.6 ± 0.85 OD

= mm2, P < 0.001 versus saline) and by 21, 39, 60% (P < 0.001 in comparison to carrageenin  alone 5.33 ± 0.19 OD = mm2, P <

0.001 versus saline), respectively.

Effect of adelmidrol on angiogenesis

 

We studied the effect of adelmidrol on vessel formation, evaluated both as haemoglobin (Hb) content and expression of CD31 pro- tein, a marker of endothelial cells. As shown in Fig. 5A, adelmidrol (15, 30, 70 mg/ml) significantly and concentration-dependently reduced Hb content in granulomatous tissue by 23, 42, 60% (P <

0.001) in comparison to carrageenin alone (53.4 ± 1.72 mg Hb/g

tissue; P < 0.001 versus saline). Immunoblotting analysis of CD31 is illustrated in Fig. 5B and shows that adelmidrol significantly and concentration-dependently inhibited λ-carrageenin-induced CD31 protein expression in granulomatous tissue by 24, 43, 60% in comparison to carrageenin alone (8.45 ± 0.78 OD = mm2). The results were confirmed by histological analysis of granulomatous tissue stained with haematoxylin/eosin  showing a deeply decrease of vessel number after adelmidrol treatment (Fig. 5C).

 

 

Discussion

 

In the present study, we investigated the potential protective effect of adelmidrol, an analogue of PEA, in a model of chronic inflam- mation, i.e. the λ-carrageenin-induced  granuloma in  rats. Although  PEA is the most thoroughly researched ALIAmide, sev- eral previous studies have pointed to the use of PEA analogues and homologues, trying to exploit their different physical and chemical properties and the relative effects [33–35]. In line with this idea, in the present study we have chosen  to evaluate the effect of the PEA analogue adelmidrol,  whose physicochemical properties favour its use in skin disorders. In fact, adelmidrol has good solubility both in aqueous and organic media, which pro- vides good transepidermal absorption.